مقدمه:
ویتامین D یک هورمون استروئیدی است که نیاز به چند مرحله متابولیک دارد تا در بدن انسان فعال شود. ویتامین D را میتوان در منابع مختلفی از جمله ماهی و تخم مرغ پیدا کرد و به دو صورت D2, or 25-hydroxy vitamin D2(ergocalciferol) و 25-hydroxy vitamin D3 (cholecalciferol) وجود دارد. این ماده همچنین در پوست پس از تابش اشعه UV از  7-dehydrocholesterol تولید می شود. هردو نوع آن در مکمل ها و مولتی ویتامین ها و به میز ان کمی در غذا ها و بافت های بیولوژیکی وجود دارد.
25-hydroxy vitamin D که در داخل و خارج بدن تولید می شود، در کلیه ها به فرم فعال بیولوژیکی 1,25-dihydroxy vitamin D (calcitriol) تبدیل می شود که این ماده به ترکیبات مختلفی تغییر شکل می یابد که ممکن است در مقادیر قابل اندازه گیری در بافت ظاهر شود.
متابولیسم ویتامین D به فرمهای غیرفعال، عمدتاً از طریق واکنش اکسید شدن رخ داده و منجر به تولید ترکیبات مختلف می شود. صرفنظر از آنها، فقط 25-hydroxy vitamin D و 1,25-dihydroxyvitamin D براساس یافته های(Institute of Medicine) IOM و دیگر سازمان ها و محققان، اهمیت پزشکی دارد و با سطح 25-hydroxy vitamin D کل بیشترین اهمیت را در تصمیم گیری های درمانی دارد.
 
اهمیت بالینی (clinical significance)
ویتامینD  در ساخت دندان ها و استخوان از طریق تنظیم هوموستاز (homeostasis) کلسیم و فسفر شناخته شده است. اخیراً شواهد جدیدی در مورد نقش ویتامین D در محافظت در برابر خطر ابتلا به سرطان های بدخیم، بیماری های قلبی عروقی و دیابت، پوکی استخوان و دیگر اختلالات استخوانی به دست آمده است. بنابراین پیشرفت بیماری های اسکلتی و غیراسکلتی ممکن است تحت تاثیر ویتامین D موجود در گردش خون باشد، زیرا بیش از 2000 ژن در ژنوم انسان وجود دارد که به ویتامین D پاسخ می دهد. ارتباط سطح ویتامین D با این بیماریها کاملاً مشخص نیست، بنابراین استاندارد سازی روش های آزمایشگاهی برای آنالیز ویتامینD  و بازبینی محدوده‌ی مرجع (refrence range) که نشان دهنده ی سلامت و بیماری است، بسیار مهم است.
در طول دهه ی گذشته کمبود 25-hydroxy vitamin D مقادیر کمتر از ng/mL 10 و سطح کافی آن بین ng/mL 100-30 تعریف شده است. برای 1,25-dihydroxy vitamin D مقدار کافی بین ng/mL 56-16  و سطوح بالاتر از ng/mL 100 سمی است. همچنین بسیاری از پزشکان بر این عقیده هستند که برای تصمیم گیری درمورد درمان پاراتیروئید هورمون (PTH) باید سطح ویتامین D در بدن در نظر گرفته شود.روش هایی که برای تست های روتین آزمایشگاهی استفاده می شود باید توانایی اندازه گیری 25-hydroxy vitamin D کل را داشته باشد.
 

روش های اندازه گیری ویتامینD
ویتامینD از طریق روش های اتصال رقابتی، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا(HPLC) و radioimmunoassay (RIA) اندازه گیری می شد. استفاده از یک کیت معمول RIA که توسط شرکت DiaSorin S.p.A ایتالیا ساخته شده بود، برای ایجاد محدوده های مرجع طی دهه گذشته مورد استفاده قرار گرفته است.
آزمایش DiaSorin 25-hydroxy vitamin D یک روش دو مرحله ای است که شامل یک استخراج سریع 25-hydroxy vitamin D و سایر متابولیت های هیدروکسیل شده از سرم و پلاسما است، سپس با استفاده از یک روند رقابتی RIA با استفاده از آنتی بادی اختصاصی برای 25-hydroxy vitamin D ادامه می یابد.
روش مرجع برای آنالیز ویتامینD، LC-MS/ MS است که می تواند vitamin D2، vitamin D3 و  D3 epimerرا جداگانه اندازه گیری کرده و با محسبات ویتامین D کل گزارش می شود. این روش توسط آزمایشگاه تغذیه ای (Nutritional Laboratory) در مرکز کنترل و پیشگیری بیماری ها (CDC) و آزمایشگاه ملی در انگلیس برای آنالیز ویتامینD برای بررسی های بهداشتی و تغذیه ای انتخاب شده است که بخشی از آن به دلیل توانایی این روش در تشخیص انواع مختلف ویتامینD در پلاسما است که ممکن است در افراد با سنین مختلف یافت شود. این روش ها کار سخت و از نظر فنی دشوار هستند.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)، 25-hydroxy vitamin D2 و D3 را به صورت مشترک اندازه گیری می کند. روش های HPLC روشی استاندارد برای این تست است و از نظر  هزینه و سختی کار به صرفه تر است. در روش Hitachi از یک ستون فاز معکوس و یک آشکار ساز آرایه دیودی استفاده می شود که در طول موج بهینه آنالیز بسیار حساسی انجام می دهد.این روش می تواند برای تجزیه و تحلیل نمونه های غذایی و بیولوژیکی استفاده شود.
روش های کروماتوگرافی جدیدتر برای بهبود حساسیت، ساده سازی مراحل و اندازه گیری همه ی فرم های ویتامین D به طور همزمان توسعه داده شده اند. مثال آن   LC-MS/MS  که برای آنالیز تمام فرم ها و متابولیت های ویتامینD شامل  D2, D3 و 25-hydroxy vitamin D به طور همزمان در سرم است.

این پروسه از یک آشکار ساز یون ساز که به عنوان یونیزاسیون عکس فشار اتمسفری atmospheric pressure photo ionization (APPI) برای فراهم نمودن حساسیت بیشتر برای آنالیز، استفاده می شود. این روش نسبت به سایر روش های LC کمتر دشوار است زیرا به پیش تغلیظ نیاز ندارد.
اگرچه اکثر روش های LC-MS می توانند ویتامین D2 و D3 را جدا سازی کرده و اندازه گیری کنند، اما روشهای immunoassay توانایی این کار را ندارند. با توجه به اختصاصی بودن آنتی بادی مورد استفاده در روش immunoassay، برخی روش های immunoassay فقط می توانند یک فرم ویتامین  D را اندازه گیری کنند، برخی دو فرم را به طور یکسان اندازه گیری می کنند و بقیه vitamin D2 و D3 را با واکنش متقابل(cross-reactivity) متفاوتی اندازه گیری می کند.
 
روش های Immunoassay
چندین روش immunoassay  تایید شده از سوی اداره ی غذا و داروی ایالات متحده (FDA) در دسترس است، از جمله روش های کمی لومینسانس immunoassay (CLIA). DiaSorin سازنده ی روش معمول RIA ، روش دیگر CLIA را ارائه داده که در آن 25-hydroxy vitamin D کل و دیگر متابولیت های هیدروکسیل شده ی ویتامین D را در سرم انسان اندازه گیری می کند. در مرحله ی اول، 25-hydroxy vitamin D از پروتئین متصل به آن جدا شده و بطور اختصاصی فاز جامد متصل می شود و سپس با افزودن vitamin D-isoluminol tracer، مواد بدون اتصال با یک چرخه ی شست وشو حذف می شوند. در مرحله بعد، واکنش دهنده ها (reagents) برای شروع واکنش chemiluminescent  اضافه می شوند. سیگنال نور توسط یک فوتو مولتی پلیر آشکار سازی می شوند. این اندازه گیری به طور معکوس با غلظت 25-hydroxy vitamin D متناسب است.
Abbott Laboratories یک روش کاملاً اتوماتیک   immunoassayبرای 25-hydroxy vitamin D ارائه داد. در این Immunoassayکمی لومینسانس میکرو ذره (chemiluminescentmicroparticle immunoassay)  (CMIA)که همراه یک پیش آماده سازی خودکار آنلاین انجام می شود که آزمایش ویتامین D را یک آزمایش روتین ساخته است. این روش در سال 2011 از سازمان غذا و دارو تاییدیه دریافت کرد.
Immuno Diagnostics Inc. (Woburn, MA) یک روش CMIA immunoassay   ارائه داده که در آن تعین کمی میزان 25-hydroxyvitamin D و دیگر متابولیت های هیدروکسیل شده در سرم یا پلاسمای انسان امکان پذیر است. این روش به طور یکسان برای  vitamin D3 و D2  اختصاصی است و حساسیتی معادل ng/mL 5.5 برای آن گزارش شده است.
روش electrochemiluminescence (ECL) اختراع F. Hoffman-La Roche AG (Basel, Switzerland) برای  cobas platform، یک آزمایش  برای اندازه گیری 25-hydroxy vitamin D پیشنهاد می دهد. این آزمون برا ی استفاده در تمامی سیستم عامل های تحلیلگر مدولار Roche cobas قابل استفاده است. این روش در سال 2012 از سازمان غذا و دارو مجوز دریافت کرد.
روشهای Enzyme immunoassay نیز در دسترس هستند. Diazyme Laboratories (Poway, CA)  روشی پیشنهاد می دهد که در آن از یک ترکیب همگن آنزیم-جفت شده ویتامین D متصل به پروتئین برای اندازه گیری سطح واقعی 25-OH vitamin D (یعنی مجموع D3 and D2) استفاده می شود. پروتئین متصل به ویتامینD، ویتامین D2  و D3 را به یک اندازه و همچنین سطح واقعی کل 25-hydroxy vitamin D را تشخیص می دهد.
یک روش  immunoassay روی پلت فرم   ADVIA Centaurکه توسط شرکت زیمنس توسعه یافته است، در دسترس است. در این روش کل ویتامین D توسط یک آزمون immunoassay رقابتی همگن مورد سنجش قرار می گیرد که در آن واحد های نور نسبی (relative light units) به عنوان نقطه ی پایان تشخیص داده می شوند.
 
نتیجه گیری
نتایج یک آزمون جامع در سال 2009 و 2010 نشان داده که اکثر روش های معمول سنجش ویتامینD، صحت، دقت و خطی بودن یکسانی را فراهم می کنند. هرچند بررسی های اخیر توسط CAP proficiency-testing survey انگلستان از طرح ارزیابی کیفیت external نشان میدهد که تنها آزمایش هایی که به طور کمی میزان ویتامین D را اندازه گیری می کند روش های HPLC، LC–MS/ MS و DiaSorin هستند.
اختصاصی بودن یکی از ویژگی های روش های immunoassay است مخصوصاً در رابطه با نسبت 25-hydroxy vitamin اندازه گیری شده. روش های کروماتوگرافی به مراتب اختصاصی تر هستند. اما به دلیل چندین مرحله ی پردازش ،کارکردن با آنها چندان آسان نیست. همچنین  HPLCو LC–MS/MS به تجهیزات گران قیمت تری احتیاج دارد اما معمولاً مواد مصرفی ارزان تری دارند. این روش ها به صورت نیمه اتوماتیک یا تمام اتوماتیک استفاده می شوند، هرچند runtime ها به طور قابل توجهی طولانی تر از روش  immunoassay است، مخصوصاً آن آزمایش هایی که روی پلت فرم های اتوماتیک انجام می شود. برای اکثر روش های HPLC و LC–MS/MS با استفاده از یک استاندارد داخلی میتوان اشتباهات را اصلاح کرد و نسبت به روش های immunoassay جواب های مثبت تری ارائه می دهند.

به طور کلی میزان دقت  روش های immunoassay، HPLC و LC–MS/MS قابل قیاس هستند، همگی حساسیت لازم برای تشخیص کمبود ویتامین  Dرا دارند.
به نظر می رسد نتایج به دست آمده از LC–MS/MS مثبت تر و نتایج حاصل از روش DiaSorin کمی منفی تر هستند. این می تواند منجر به یک اختلاف در تفسیر نتایج شود. در این صورت تعداد بیمارانی که با روش DiaSorin در دسته ی ویتامینD ناکافی یا کمبود شدید قرار می گیرند بیشتر از بیمارانی هستند که سطح ویتامینD آنها با LC–MS/MS سنجیده شده است.
اخیراً مطالعه ای برای ارزیابی عملکرد 5 روش خودکار immunoassay  (the Abbott ARCHITECT, DiaSorin LIAISON, IDS i-SYS, Roche [E170, monoclonal 25-hydroxy vitamin D3 assay], and Siemens ADVIA Centaur) و یک روش  RIA (DiaSorin)و 2 روش LC–MS/MS انجام شده است. روشهای immunoassay  تغییرات بیشتری را نشان می دهند، روشهای LC–MS/MS تکرار پذیری خوبی نشان دادند. RIA نتایجی مشابه نتایج LC–MS/MS نشان داد. همه ی روشهای immunoassay سطح 25-hydroxy vitamin D را نشان می دهد به جز آزمون Roche که فقط میزان ویتامین  D3را اندازه گیری می کند. آزمون  25-hydroxy vitamin D3 Roche اختلاف میانگین کمی را نشان می دهد. اکثر آزمون ها دقت intra assay و inter assay خوبی را با ضریب تغییرات(CV) کمتر از %10نشان می دهد.
Holmes و همکارانش نتایج روش های immunoassay Abbot ARCHITECT  و Siemens ADVIA Centaur  برای تعیین سطح 25-hydroxy vitamin D را با نتایج LC–MS/MS مقایسه کردند. برای هردو روش immunoassay نتایج خطای مثبتی ثبت شد که نتایج مبنی بر کمبود ویتامین D نشان می دهد که منجر به سوء درمان ویتامینD می شود.
 
بحث
مقایسه بین روش های HPLC و روش های immunoassay که قبلاً منتشر شده بود، اختلاف معنی داری در نتایج را نشان می دهد که نشان دهنده ی عدم صحت روش های immunoassay در مقایسه با روش مرجع (REFRENCE) است. هر چند بهبود روش ها موجب همبستگی بهتر نتایج در مقایسه با روش های استفاده شده در مطالعات سال 2005 شده است و همپوشانی خوبی میان نتایج حاصل از روش DiaSorin LIASON و روشهای  LC-MS/MS وجود دارد.

:Reference

Current Methods for Routine Laboratory Testing of Vitamin D Levels

Wendy L Arneson, MS, MLS(ASCP)CM , and Dean L Arneson, PharmD, PhD

Lab Medicine Winter ۲۰۱۳ | Volume ۴۴, Number ۱

: